革蘭氏染色法

（一）原理：

用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。堿性染料的離子帶正電荷，能和帶負(fù)電荷的物質(zhì)結(jié)合。因細(xì)菌蛋白質(zhì)等電點(diǎn)較低，當(dāng)它生長于中性、堿性或弱酸性的溶液中時(shí)常帶負(fù)電荷，所以通常采用堿性染料（如美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅或孔雀綠等）使其著色。酸性染料的離子帶負(fù)電荷，能與帶正電荷的物質(zhì)結(jié)合。當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時(shí)，細(xì)菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料著色。中性染料是前兩者的結(jié)合物又稱復(fù)合染料，如伊紅美藍(lán)、伊紅天青等。

簡單染色法是只用一種染料使細(xì)菌著色以顯示其形態(tài)，簡單染色不能辨別細(xì)菌細(xì)胞的構(gòu)造。

革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家C.Gram所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G—）兩大類，是細(xì)菌學(xué)上zui常用的鑒別染色法。該染色法所以能將細(xì)菌分為G+菌和G—菌，是由這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。G—菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時(shí)溶解了類脂質(zhì)，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)蕃紅復(fù)染后就成紅色。G+菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細(xì)菌仍保留初染時(shí)的顏色。

（二）器材

1、菌株：培養(yǎng)12-16h的蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草桿菌（Bacillus subtilis），培養(yǎng)24小時(shí)的大腸桿菌（Escherichia coli）

2、染色液和試劑：結(jié)晶紫、盧哥氏碘液、95%酒精、蕃紅、復(fù)紅、二甲苯、香柏油

3、器材：廢液缸、洗瓶、載玻片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡

（三）革蘭氏染色方法：

1、以酒精擦拭玻片，在酒精燈上干燥后，用接種環(huán)挑取一環(huán)滅菌的去離子水或生理鹽水到載玻片上，挑取少量純培養(yǎng)物在水滴上涂抺至均勻分散，將涂片在酒精燈火焰上滅活、固定。

2、滴加結(jié)晶紫染色液1-2 滴，染1 分鐘，用去離子水輕輕水洗。

3、待干，滴加革蘭氏碘液，作用1 分鐘，用去離子水輕輕水洗。

4、滴洗脫色劑（95%酒精），不時(shí)搖動玻片，直至無紫色脫落為止（約10～20 秒），用去離子水輕輕水洗。

5、待干，滴加沙黃復(fù)染液，復(fù)染30 秒。用去離子輕輕水洗，待玻片干燥后鏡檢。

6、油鏡鏡檢。菌體呈紫色者為革蘭氏陽性菌；呈紅色者為革蘭氏陰性菌。

（四）注意事項(xiàng) 

1.革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時(shí)間過短，革蘭氏陰性菌也會被染成革蘭氏陽性菌。脫色時(shí)間的長短還受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴(yán)格規(guī)定。 

2.染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應(yīng)吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。 

3.選用幼齡的細(xì)菌。G+菌培養(yǎng)12h-16h，E.coli培養(yǎng)24h。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。

細(xì)菌芽孢染色法

（一）原理

細(xì)菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易著色，若用一般染色法只能使菌體著色而芽胞不著色（芽胞呈無色透明狀）。芽胞染色法就是根據(jù)芽胞既難以染色而一旦染上色后又難以脫色這一特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的。所有的芽胞染色法都基于同一個(gè)原則：除了用著色力強(qiáng)的染料外，還需要加熱，以促進(jìn)芽胞著色。當(dāng)染芽胞時(shí)，菌體也會著色，然后水洗，芽胞染上的顏色難以滲出，而菌體會脫色。然后用對比度強(qiáng)的染料對菌體復(fù)染，使菌體和芽胞呈現(xiàn)出不同的顏色，因而能更明顯地襯托出芽胞，便于觀察。

（二）器材 

1.菌株：培養(yǎng)36小時(shí)的蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草桿菌（Bacillus subtilis）。 

2.染色液和試劑：5%孔雀綠水溶液、0.5%蕃紅水溶液 3.器材：小試管（75mm×10mm）、燒杯（300mL）、滴管、玻片擱架、接種環(huán)、擦鏡紙、鑷子、顯微鏡等。

（三）方法 

1.改良的Schaeffer和Fulton氏染色法 

（1）制備菌液：加1—2滴無菌水于小試管中，用接種環(huán)從斜面上挑取2—3環(huán)的菌體于試管中并充分打勻，制成濃稠的菌液。 

（2）加染色液：加5%孔雀綠水溶液2—3滴于小試管中，用接種環(huán)攪拌使染料與菌液充分混合。 

（3）加熱：將此試管浸于沸水?。訜?5—20min。 

（4）涂片：用接種環(huán)從試管底部挑數(shù)環(huán)菌液于潔凈的載玻片上，做成涂面，晾干。 

（5）固定：將涂片通過酒精燈火焰3次。 

（6）脫色：用水洗直至流出的水中無孔雀綠顏色為止。 

（7）復(fù)染：加蕃紅水溶液染色5min后，傾去染色液，不用水洗，直接用吸水紙吸干。 

（8）鏡檢：先低倍，再高倍，最后用油鏡觀察。 結(jié)果：芽胞呈綠色，芽胞囊和菌體為紅色。

2.Schaeffer與Fulton氏染色法 

（1）涂片：按常規(guī)方法將待檢細(xì)菌制成一薄的涂片。 

（2）晾干固定：待涂片晾干后在酒精燈火焰上通過2—3次。

（3）染色：

①加染色液：加5%孔雀綠水溶液于涂片處（染料以鋪滿涂片為度），然后將涂片放在銅板上，用酒精燈火焰加熱至染液冒蒸汽時(shí)開始計(jì)算時(shí)間，約維持15-20min。加熱過程中要隨時(shí)添加染色液，切勿讓標(biāo)本干涸。（加熱時(shí)溫度不能太高）。

②水洗：待玻片冷卻后 ，用水輕輕地沖洗，直至流出的水中無染色液為止。 ③復(fù)染：用蕃紅液染色5min。 （4）水洗、晾干或吸干。 （5）鏡檢：先低倍，再高倍，最后在油鏡下觀察芽胞和菌體的形態(tài)。。 結(jié)果：芽胞呈綠色，菌體為紅色。

（四）注意事項(xiàng)

1.供芽胞染色用的菌種應(yīng)控制菌齡。 

2.改良法在節(jié)約染料、簡化操作及提高標(biāo)本質(zhì)量等方面都較常規(guī)涂片法*，可優(yōu)先使用。 

3.用改良法時(shí)，欲得到好的涂片，首先要制備濃稠的菌液，其次是從小試管中取染色的菌液時(shí)，應(yīng)先用接種環(huán)充分?jǐn)嚢?，然后再挑取菌液，否則菌體沉于管底，涂片時(shí)菌體太少。

細(xì)菌的莢膜染色法

（一）原理

由于莢膜與染料間的親和力弱，不易著色，通常采用負(fù)染色法染莢膜，即設(shè)法使菌體和背景著色而莢膜不著色，從而使莢膜在菌體周圍呈一透明圈。由于莢膜的含水量在90%以上，故染色時(shí)一般不加熱固定，以免莢膜皺縮變形。

（二）器材

1.菌株：培養(yǎng)3-5天的膠質(zhì)芽胞桿菌（Bacillus mucilaginosus，俗稱“鉀細(xì)菌"）。該菌在甘露醇作碳源的培養(yǎng)基上生長時(shí)，莢膜豐厚。 

2.染色液和試劑 ：Tyler法染色液、用濾紙過濾后的繪圖墨水、復(fù)紅染色液、黑素、6%葡萄糖水溶液、1%甲基紫水溶液、甲醇、20%CuSO4水溶液、香柏油、二甲苯。

3.器材： 載玻片、玻片擱架， 擦鏡紙、顯微鏡等。

（三）方法 

推薦以下四種染色法，其中以濕墨水方法較簡便，并且適用于各種有莢膜的細(xì)菌。如用相差顯微鏡檢查則效果更佳。

1.負(fù)染色法： 

（1）制片：取潔凈的載玻片一塊，加蒸餾水一滴，取少量菌體放入水滴中混勻并涂布。 

（2）干燥：將涂片放在空氣中晾干或用電吹風(fēng)冷風(fēng)吹干。 

（3）染色：在涂面上加復(fù)紅染色液染色2—3min。 

（4）水洗：用水洗去復(fù)紅染液。

（5）干燥：將染色片放空氣中晾干或用電吹風(fēng)冷風(fēng)吹干。 

（6）涂黑素：在染色涂面左邊加一小滴黑素，用一邊緣光滑的載玻片輕輕接觸黑素，使黑素沿玻片邊緣散開，然后向右一拖，使黑素在染色涂面上成為一薄層，并迅速風(fēng)干。 

（7）鏡檢：先低倍鏡，再高倍鏡觀察。 結(jié)果：背影灰色，菌體紅色，莢膜無色透明。

2.濕墨水法 

（1）制菌液：加1滴墨水于潔凈的載玻片上，挑少量菌體與其充分混合均勻。 

（2）加蓋玻片 放一清潔蓋玻片于混合液上，然后在蓋玻片上放一張濾紙，向下輕壓，吸去多余的菌液。 

（3）鏡檢：先用低倍鏡、再用高倍鏡觀察。 

結(jié)果：背景灰色，菌體較暗，在其周圍呈現(xiàn)一明亮的透明圈即為莢膜。

3.干墨水法 

（1）制菌液：加1滴6%葡萄糖液于潔凈載玻片一端，挑少量膠質(zhì)芽胞桿菌與其充分混合，再加1環(huán)墨水，充分混勻。 

（2）制片：左手執(zhí)玻片，右手另拿一邊緣光滑的載玻片，將載玻片的一邊與菌液接觸，使菌液沿玻片接觸處散開，然后以30度角，迅速而均勻地將菌液拉向玻片的一端，使菌液鋪成一薄膜。 

（3）干燥：空氣中自然干燥。 

（4）固定：用甲醇浸沒涂片，固定1 min，立即傾去甲醇。 

（5）干燥：在酒精燈上方，用文火干燥。 

（6）染色：用甲基紫染1—2min。 

（7）水洗：用自來水輕洗，自然干燥。 

（8）鏡檢：先用低倍鏡再高倍鏡觀察。 結(jié)果：背景灰色，菌體紫色，莢膜呈一清晰透明圈。

4.Tyler法 

（1）涂片：按常規(guī)法涂片，可多挑些菌體與水充分混合，并將粘稠的菌液盡量涂開，但涂布的面積不宜過大。 

（2）干燥：在空氣中自然干燥。

（3）染色：用Tyler染色液染5—7min。 

（4）脫色：用20%CuSO4水溶液洗去結(jié)晶紫，脫色要適度（沖洗2遍）。用吸水紙吸干，并立即加1—2滴香柏油于涂片處，以防止CuSO4結(jié)晶的形成。 

（5）鏡檢：先用低倍鏡再用高倍鏡觀察。觀察完畢后注意用二甲苯擦去鏡頭上的香柏油。 結(jié)果：背景藍(lán)紫色，菌體紫色，莢膜無色或淺紫色。

（四）注意事項(xiàng)

1.加蓋玻片時(shí)不可有氣泡，否則會影響觀察。

2.應(yīng)用干墨水法時(shí)，涂片要放在火焰較高處并用文火干燥，不可使玻片發(fā)熱。 

3.在采用Tyler法染色時(shí)，標(biāo)本經(jīng)染色后不可用水洗，必須用20%CuSO4沖洗